Лазерная фазовая пластина: новый метод повышения контраста в криоэлектронной микроскопии

Когда оптические микроскопы позволили увидеть отдельные клетки, ученые столкнулись с проблемой низкой контрастности: клетки животных и растений прозрачны для видимого света. Мелкие структуры, вроде ядер и митохондрий, рассеивают мало света, и их трудно различить без окрашивания, которое изменяет клетку. Решение нашел Фриц Цернике, предложив фазовую пластину, за что получил Нобелевскую премию. Он заметил, что свет, рассеиваясь на образце, не только теряет яркость, но и меняет фазу. Сдвинув фазу нерассеянного света на 90 градусов, можно заставить его интерферировать с рассеянным, повышая контраст.

Проблема электронной микроскопии

В электронной микроскопии, где вместо фотонов используются электроны, также возникла проблема контраста. Однако создать аналог фазовой пластины для электронов оказалось сложно: попытки менять фазу пучка приводили к снижению интенсивности, нестабильности изображения или ухудшению разрешения. Физики из Калифорнийского университета в Беркли после более 10 лет исследований нашли выход, заменив традиционную фазовую пластину лазерным излучением.

Они сфокусировали непрерывный лазер мощностью 75 кВт в пятно размером несколько микрон. В точке пересечения с электронным пучком лазерное излучение сдвигает фазу электронов на 90 градусов благодаря накопленной энергии. Это позволило улучшить контраст без существенной потери интенсивности или разрешения.

Успешная демонстрация

В статье, опубликованной в журнале Science, исследователи показали восстановленные изображения фермента альдолазы и гемоглобина — белка, переносящего кислород в крови. Лазерная фазовая пластина особенно улучшила видимость гемоглобина, который ранее был на пределе возможностей современных приборов.

Современная криоэлектронная микроскопия с трудом визуализирует белки меньше 70 килодальтон, а такие белки составляют около 90% всех белков организма человека. С лазерной фазовой пластиной стало возможно рассматривать белки размером до 50 килодальтон, что охватывает уже половину белков человека. Авторы надеются довести разрешение до размеров миоглобина (около 17 кДа).

«Это дополнение к криоэлектронной микроскопии может заполнить огромный пробел в наших знаниях о структурах белков, которые невозможно кристаллизовать или которые слишком малы для современного состояния техники. А для криоэлектронной томографии это будет революцией», — рассказал профессор физики Хольгер Мюллер, руководивший разработкой. Исследователи считают, что такая точность может качественно изменить понимание механизмов возникновения и протекания болезней.